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Protospacer-Adjacent-Motif (PAM)

2008
  • Luciano Marraffini
  • Erik Sontheimer
Molekularbiologe bei der Analyse von DNA-Sequenzen mit Schwerpunkt auf dem Protospacer Adjacent Motif in einem Labor.

(Abbildung dient nur zur Veranschaulichung)

Das Protospacer Adjacent Motif (PAM) ist eine kurze, spezifische DNA-Sequenz, typischerweise 2–6 Basenpaare lang, die für die Bindung und Spaltung einer Ziel-DNA-Sequenz durch eine Cas-Nuklease erforderlich ist. Es befindet sich unmittelbar stromabwärts der Zielsequenz (Protospacer) in der eindringenden DNA. Das PAM ist in der Wirts-DNA nicht vorhanden. CRISPR locus, which serves as a critical self-versus-non-self recognition mechanism, preventing autoimmune destruction.

Die Entdeckung des Protospacer Adjacent Motif (PAM) war ein entscheidender Moment für das Verständnis der präzisen Funktionsweise des CRISPR-Cas-Systems. Forscher beobachteten, dass für die erfolgreiche Erkennung und Spaltung fremder DNA eine spezifische kurze Sequenz neben der Zielsequenz (dem Protospacer) vorhanden sein muss. Für das weit verbreitete Cas9 aus *Streptococcus pyogenes* lautet diese Sequenz 5'-NGG-3', wobei 'N' für jedes beliebige Nukleotid stehen kann. Das mit seiner Guide-RNA beladene Cas9-Protein scannt zunächst die DNA nach dieser PAM-Sequenz. Erst nach der Bindung an ein PAM versucht das Protein, die angrenzende DNA zu entwinden und auf eine Übereinstimmung mit seiner Guide-RNA-Sequenz zu prüfen. Wird eine Übereinstimmung gefunden, werden die Nukleasedomänen von Cas9 aktiviert, um einen Doppelstrangbruch zu erzeugen.

This PAM-dependent targeting mechanism is the key to how the system avoids attacking the bacterium’s own genome. The CRISPR array, from which the guide RNAs are derived, contains the same spacer sequences as the targets. However, the repeat sequences within the CRISPR array do not contain the PAM sequence. Consequently, the Cas9-gRNA complex cannot bind stably to the CRISPR locus itself, preventing an autoimmune catastrophe. This elegant solution for self/non-self discrimination is a hallmark of the system’s efficiency. For gene editing applications, the PAM requirement is a double-edged sword: it ensures specificity but also constrains the set of possible target sites in a genome. This has driven significant research into discovering or engineering Cas variants with different, more flexible, or even non-existent PAM requirements to make any part of the genome accessible to editing.

UNESCO Nomenclature: 2417
Molekularbiologie

Typ

Biochemischer Mechanismus

Störung

Wesentliche

Verwendung

Weitverbreitete Verwendung

Vorläufer

  • Charakterisierung der crispr-cas9 Systemkomponenten
  • Verständnis der Protein-DNA-Bindungsinteraktionen und -Spezifität
  • Die Hypothese von Crispr als DNA-gerichtetes Immunsystem
  • In-vitro-Tests zum Testen der CAS-Proteinaktivität auf verschiedenen DNA-Substraten

Anwendungen

  • eine kritische Regel für die Entwicklung von Leit-RNAs bei der CRISPR-Cas9-Genbearbeitung
  • Ermöglicht die Vorhersage potenzieller Off-Target-Stellen in einem Genom
  • Entwicklung von CAS-Proteinen mit veränderten PAM-Spezifitäten, um den Bereich editierbarer genomischer Stellen zu erweitern
  • eine Grundlage für die Entwicklung hochpräziser Cas9-Varianten, die Off-Target-Effekte reduzieren

Patente:

NA

Potenzielle Innovationsideen

  • developing ‘pam-less’ cas nucleases through directed evolution for unrestricted Genom-Editierung
  • Entwicklung eines Diagnosetools, das nur beim Erkennen einer pathogenspezifischen PAM-Sequenz aktiviert wird
  • Entwurf eines DNA-Datenspeichersystems, bei dem die PAM-Sequenz als Dateikopf oder Indexmarkierung fungiert
  • Entwicklung von CAS-Proteinen, die methylierte DNA als PAM erkennen und so eine epigenomspezifische Bearbeitung ermöglichen
  • creating a ‘pam-lock’ system where a therapeutic gene is only activated in cells containing a viral pam sequence
  • Entwicklung einer Bibliothek orthogonaler Cas-Pam-Paare für die komplexe, multigene Regulierung in synthetischen Organismen
  • using pam-binding domains as dna ‘stains’ for super-resolution microscopy of genomic regions
  • Schaffung eines Systems, bei dem die PAM-Erkennung durch Licht aktiviert wird und das eine räumlich-zeitliche Kontrolle über die Genbearbeitung ermöglicht
  • engineering a cas protein that leaves a permanent ‘scar’ at the pam site after binding, creating a molecular event recorder
  • Entwicklung eines Computertools zur Vorhersage der Evolution viraler PAM-Sequenzen, wenn diese dem Crispr-Druck entgehen
Verwandt mit: PAM, Protospacer Adjacent Motif, Cas9, Selbsterkennung, DNA-Targeting, Genomeditierung, S. pyogenes, Off-Target, Biochemie, NGG.

Historischer Kontext

1990
1997
2000
2008
1990
1990
1997
2000

(wenn das Datum unbekannt oder nicht relevant ist, z. B. „Strömungsmechanik“, wird eine gerundete Schätzung seines bemerkenswerten Auftretens bereitgestellt)

10. Jahr Jubiläum

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