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Motivo adiacente al protospacer (PAM)

2008
  • Luciano Marraffini
  • Erik Sontheimer
Biologo molecolare che analizza la sequenza del DNA con particolare attenzione al Protospacer Adjacent Motif in laboratorio.

(Immagine generata a solo scopo illustrativo)

Il motivo adiacente al protospacer (PAM) è una breve e specifica sequenza di DNA, tipicamente lunga da 2 a 6 paia di basi, necessaria affinché una nucleasi Cas si leghi e tagli una sequenza di DNA bersaglio. Si trova immediatamente a valle del sito bersaglio (protospacer) nel DNA invasore. Il PAM non è presente nel DNA dell'ospite. CRISPR locus, which serves as a critical self-versus-non-self recognition mechanism, preventing autoimmune destruction.

La scoperta del Protospacer Adjacent Motif (PAM) è stata un momento cruciale per comprendere il funzionamento del sistema CRISPR-Cas con tale precisione. I ricercatori hanno osservato che, affinché il sistema potesse individuare e tagliare con successo il DNA estraneo, era necessaria la presenza di una specifica sequenza breve accanto alla sequenza bersaglio (il protospacer). Per la proteina Cas9, ampiamente utilizzata e derivata da *Streptococcus pyogenes*, questa sequenza è 5'-NGG-3', dove 'N' può essere un qualsiasi nucleotide. La proteina Cas9, caricata con il suo RNA guida, analizza inizialmente il DNA alla ricerca di questa sequenza PAM. Solo dopo essersi legata a un PAM, la proteina tenta di svolgere il DNA adiacente e verifica la presenza di una corrispondenza con la sua sequenza di RNA guida. Se viene trovata una corrispondenza, i domini nucleasici di Cas9 vengono attivati ​​per creare una rottura a doppio filamento.

This PAM-dependent targeting mechanism is the key to how the system avoids attacking the bacterium’s own genome. The CRISPR array, from which the guide RNAs are derived, contains the same spacer sequences as the targets. However, the repeat sequences within the CRISPR array do not contain the PAM sequence. Consequently, the Cas9-gRNA complex cannot bind stably to the CRISPR locus itself, preventing an autoimmune catastrophe. This elegant solution for self/non-self discrimination is a hallmark of the system’s efficiency. For gene editing applications, the PAM requirement is a double-edged sword: it ensures specificity but also constrains the set of possible target sites in a genome. This has driven significant research into discovering or engineering Cas variants with different, more flexible, or even non-existent PAM requirements to make any part of the genome accessible to editing.

UNESCO Nomenclature: 2417
Biologia molecolare

Tipo

Meccanismo biochimico

Interruzione

Sostanziale

Utilizzo

Uso diffuso

Precursori

  • caratterizzazione del crispr-cas9 componenti del sistema
  • comprensione delle interazioni e della specificità del legame proteina-DNA
  • l'ipotesi di Crispr come sistema immunitario che prende di mira il DNA
  • saggi in vitro per testare l'attività della proteina cas su diversi substrati di DNA

Applicazioni

  • una regola critica per la progettazione di RNA guida nell'editing genetico CRISPR-Cas9
  • consentendo la previsione di potenziali siti fuori bersaglio in un genoma
  • proteine ​​cas ingegnerizzate con specificità pam alterate per ampliare la gamma di siti genomici modificabili
  • una base per lo sviluppo di varianti cas9 ad alta fedeltà che riducono gli effetti off-target

Brevetti:

NA

Idee e potenziali innovazioni

  • developing ‘pam-less’ cas nucleases through directed evolution for unrestricted editing del genoma
  • creazione di uno strumento diagnostico che si attiva solo dopo aver rilevato una sequenza pam specifica del patogeno
  • progettazione di un sistema di archiviazione dei dati del DNA in cui la sequenza PAM funge da intestazione di file o marcatore di indice
  • proteine ​​cas ingegnerizzate che riconoscono il DNA metilato come un pam, consentendo l'editing specifico dell'epigenoma
  • creating a ‘pam-lock’ system where a therapeutic gene is only activated in cells containing a viral pam sequence
  • sviluppo di una libreria di coppie cas-pam ortogonali per la regolazione complessa e multi-genica negli organismi sintetici
  • using pam-binding domains as dna ‘stains’ for super-resolution microscopy of genomic regions
  • creazione di un sistema in cui il riconoscimento pam è attivato dalla luce, fornendo un controllo spaziotemporale sull'editing genetico
  • engineering a cas protein that leaves a permanent ‘scar’ at the pam site after binding, creating a molecular event recorder
  • progettazione di uno strumento computazionale per prevedere l'evoluzione delle sequenze virali PAM mentre sfuggono alla pressione Crispr
Correlato a: PAM, motivo adiacente al protospacer, cas9, auto-riconoscimento, targeting del DNA, editing genetico, s. pyogenes, fuori bersaglio, biochimica, NGG.

Contesto storico

Motivo adiacente al protospacer (PAM)

1990
1997
2000
2008
1990
1990
1997
2000

(se la data è sconosciuta o non rilevante, ad esempio "meccanica dei fluidi", viene fornita una stima approssimativa della sua notevole comparsa)

decimo anno anniversario

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