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Motivo adjacente ao protoespaçador (PAM)

2008
  • Luciano Marraffini
  • Erik Sontheimer
Molecular biologist analyzing DNA sequence with focus on Protospacer Adjacent Motif in a laboratory.

(Imagem gerada apenas para fins ilustrativos)

O Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM, na sigla em inglês) é uma sequência de DNA curta e específica, tipicamente de 2 a 6 pares de bases, necessária para que uma nuclease Cas se ligue e clive uma sequência de DNA alvo. Ele está localizado imediatamente a jusante do sítio alvo (protoespaçador) no DNA invasor. O PAM não está presente no próprio DNA hospedeiro. CRISPR locus, which serves as a critical self-versus-non-self recognition mechanism, preventing autoimmune destruction.

A descoberta do Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM, na sigla em inglês) foi um momento crucial para a compreensão do funcionamento preciso do sistema CRISPR-Cas. Os pesquisadores observaram que, para o sistema atingir e clivar o DNA exógeno com sucesso, uma pequena sequência específica precisava estar presente próxima à sequência alvo (o protoespaçador). Para a Cas9, amplamente utilizada e proveniente da bactéria *Streptococcus pyogenes*, essa sequência é 5'-NGG-3', onde 'N' pode ser qualquer nucleotídeo. A proteína Cas9, carregada com seu RNA guia, primeiro examina o DNA em busca dessa sequência PAM. Somente ao se ligar a um PAM, a proteína tenta desenrolar o DNA adjacente e verificar se há correspondência com a sequência do seu RNA guia. Se uma correspondência for encontrada, os domínios de nuclease da Cas9 são ativados para criar uma quebra de fita dupla.

This PAM-dependent targeting mechanism is the key to how the system avoids attacking the bacterium’s own genome. The CRISPR array, from which the guide RNAs are derived, contains the same spacer sequences as the targets. However, the repeat sequences within the CRISPR array do not contain the PAM sequence. Consequently, the Cas9-gRNA complex cannot bind stably to the CRISPR locus itself, preventing an autoimmune catastrophe. This elegant solution for self/non-self discrimination is a hallmark of the system’s efficiency. For gene editing applications, the PAM requirement is a double-edged sword: it ensures specificity but also constrains the set of possible target sites in a genome. This has driven significant research into discovering or engineering Cas variants with different, more flexible, or even non-existent PAM requirements to make any part of the genome accessible to editing.

UNESCO Nomenclature: 2417
Biologia molecular

Tipo

Mecanismo Bioquímico

Interrupção

Substancial

Uso

Uso generalizado

Precursores

  • caracterização do crispr-cas9 componentes do sistema
  • Compreensão das interações de ligação proteína-DNA e especificidade
  • a hipótese do CRISPR como um sistema imunológico direcionado ao DNA
  • Ensaios in vitro para testar a atividade da proteína Cas em diferentes substratos de DNA.

Aplicações

  • Uma regra crucial para o projeto de RNAs guia na edição genética CRISPR-Cas9.
  • permitindo a previsão de potenciais locais fora do alvo em um genoma.
  • Engenharia de proteínas Cas com especificidades PAM alteradas para expandir a gama de sítios genômicos editáveis.
  • uma base para o desenvolvimento de variantes Cas9 de alta fidelidade que reduzem os efeitos fora do alvo

Patentes:

NA

Ideias de Inovação Potencial

  • developing ‘pam-less’ cas nucleases through directed evolution for unrestricted genome editing
  • creating a diagnostic tool that only activates upon detecting a pathogen-specific pam sequence
  • designing a dna data storage system where the pam sequence acts as a file header or index marker
  • engineering cas proteins that recognize methylated dna as a pam, allowing for epigenome-specific editing
  • creating a ‘pam-lock’ system where a therapeutic gene is only activated in cells containing a viral pam sequence
  • developing a library of orthogonal cas-pam pairs for complex, multi-gene regulation in synthetic organisms
  • using pam-binding domains as dna ‘stains’ for super-resolution microscopy of genomic regions
  • creating a system where pam recognition is light-activated, providing spatiotemporal control over gene editing
  • engineering a cas protein that leaves a permanent ‘scar’ at the pam site after binding, creating a molecular event recorder
  • designing a computational tool to predict the evolution of viral pam sequences as they escape crispr pressure
Relacionado a: PAM, motivo adjacente ao protoespaçador, cas9, autorreconhecimento, direcionamento de DNA, edição genética, s. pyogenes, alvo não específico, bioquímica, NGG.

Contexto histórico

Motivo adjacente ao protoespaçador (PAM)

1990
1997
2000
2008
1990
1990
1997
2000

(Caso a data seja desconhecida ou irrelevante, por exemplo, "mecânica dos fluidos", é fornecida uma estimativa aproximada de seu surgimento notável)

10º ano aniversário

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