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Motivo adyacente al protoespaciador (PAM)

2008
  • Luciano Marraffini
  • Erik Sontheimer
Biólogo molecular analizando una secuencia de ADN centrada en el motivo adyacente al protoespaciador en un laboratorio.

(Imagen generada únicamente con fines ilustrativos)

El motivo adyacente al protoespaciador (PAM) es una secuencia de ADN corta y específica, normalmente de 2 a 6 pares de bases de longitud, necesaria para que una nucleasa Cas se una a una secuencia de ADN diana y la corte. Se encuentra inmediatamente aguas abajo del sitio diana (protospacer) en el ADN invasor. El PAM no está presente en el ADN del huésped. CRISPR locus, which serves as a critical self-versus-non-self recognition mechanism, preventing autoimmune destruction.

El descubrimiento del Protospacer Adjacent Motif (PAM) fue un momento crucial para entender cómo funciona el sistema CRISPR-Cas con tanta precisión. Los investigadores observaron que para que el sistema se dirigiera con éxito al ADN extraño y lo cortara, tenía que haber una secuencia corta específica junto a la secuencia diana (el protoespaciador). Para el ampliamente utilizado Cas9 de *Streptococcus pyogenes*, esta secuencia es 5′-NGG-3′, donde ‘N’ puede ser cualquier nucleótido. La proteína Cas9, cargada con su ARN guía, busca primero esta secuencia PAM en el ADN. Sólo cuando se une a una PAM, la proteína intenta desenrollar el ADN adyacente y comprobar si coincide con su secuencia de ARN guía. Si se encuentra una coincidencia, los dominios nucleasa de Cas9 se activan para crear una rotura de doble cadena.

This PAM-dependent targeting mechanism is the key to how the system avoids attacking the bacterium’s own genome. The CRISPR array, from which the guide RNAs are derived, contains the same spacer sequences as the targets. However, the repeat sequences within the CRISPR array do not contain the PAM sequence. Consequently, the Cas9-gRNA complex cannot bind stably to the CRISPR locus itself, preventing an autoimmune catastrophe. This elegant solution for self/non-self discrimination is a hallmark of the system’s efficiency. For gene editing applications, the PAM requirement is a double-edged sword: it ensures specificity but also constrains the set of possible target sites in a genome. This has driven significant research into discovering or engineering Cas variants with different, more flexible, or even non-existent PAM requirements to make any part of the genome accessible to editing.

UNESCO Nomenclature: 2417
- Biología molecular

Tipo

Mecanismo bioquímico

Ruptura

Sustancial

Uso

Uso generalizado

Precursores

  • caracterización de la crispr-cas9 componentes del sistema
  • Comprensión de las interacciones y la especificidad de la unión proteína-ADN
  • La hipótesis de CRISPR como un sistema inmunológico dirigido al ADN
  • Ensayos in vitro para probar la actividad de la proteína cas en diferentes sustratos de ADN

Aplicaciones

  • Una regla crítica para el diseño de ARN guía en la edición genética CRISPR-Cas9
  • Permitiendo la predicción de posibles sitios fuera del objetivo en un genoma
  • Ingeniería de proteínas cas con especificidades pam alteradas para ampliar la gama de sitios genómicos editables
  • Una base para desarrollar variantes de cas9 de alta fidelidad que reduzcan los efectos fuera del objetivo

Patentes:

NA

Ideas para posibles innovaciones

  • developing ‘pam-less’ cas nucleases through directed evolution for unrestricted genome editing
  • Creación de una herramienta de diagnóstico que solo se activa al detectar una secuencia pam específica del patógeno.
  • Diseño de un sistema de almacenamiento de datos de ADN donde la secuencia PAM actúa como encabezado de archivo o marcador de índice.
  • Ingeniería de proteínas cas que reconocen el ADN metilado como un PAM, lo que permite la edición específica del epigenoma.
  • creating a ‘pam-lock’ system where a therapeutic gene is only activated in cells containing a viral pam sequence
  • Desarrollo de una biblioteca de pares cas-pam ortogonales para la regulación compleja de múltiples genes en organismos sintéticos.
  • using pam-binding domains as dna ‘stains’ for super-resolution microscopy of genomic regions
  • Creación de un sistema en el que el reconocimiento de PAM se activa con la luz, lo que proporciona un control espaciotemporal sobre la edición genética.
  • engineering a cas protein that leaves a permanent ‘scar’ at the pam site after binding, creating a molecular event recorder
  • Diseño de una herramienta computacional para predecir la evolución de las secuencias pam virales a medida que escapan a la presión crispr.
Relacionado con: PAM, motivo adyacente protospacer, cas9, autorreconocimiento, DNA targeting, edición génica, s. pyogenes, off-target, bioquímica, NGG.

Contexto histórico

Motivo adyacente al protoespaciador (PAM)

1990
1997
2000
2008
1990
1990
1997
2000

(Si la fecha es desconocida o no es relevante, por ejemplo "mecánica de fluidos", se proporciona una estimación redondeada de su aparición notable)

décimo año aniversario

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