CRISPR-Cas9 als programmierbares Werkzeug zur Genom-Editierung

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for Genom-Editierung was a landmark achievement in MolekularbiologieDie entscheidende Erkenntnis bestand darin, das Reprogrammierungspotenzial des Systems zu erkennen. In seiner natürlichen Form verwendet das Typ-II-System drei Komponenten: das Cas9-Protein, eine crRNA mit der Zielsequenz und eine tracrRNA, die für die crRNA-Reifung und die Cas9-Aktivierung unerlässlich ist. Die Arbeitsgruppen von Doudna und Charpentier zeigten, dass dieses System vereinfacht werden kann. Sie konstruierten eine einzelne chimäre RNA, die sie als Einzel-Guide-RNA (sgRNA) bezeichneten, indem sie das 3'-Ende der crRNA mit dem 5'-Ende der tracrRNA mittels einer synthetischen Haarnadelstruktur verbanden. Diese sgRNA behielt alle notwendigen Funktionen des Dual-RNA-Systems bei.

Diese Vereinfachung war revolutionär, da sie bedeutete, dass man, um die Cas9-Nuklease auf eine neue DNA-Stelle auszurichten, lediglich eine neue sgRNA mit einer anderen 20-Nukleotid-Führungssequenz synthetisieren musste. Dadurch wurde die Technologie im Vergleich zu früheren Bearbeitungsmethoden wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) und TALENs, die für jedes neue Ziel eine komplexe und kostspielige Proteinentwicklung erforderten, bemerkenswert einfach, kostengünstig und skalierbar. Wenn der Cas9-sgRNA-Komplex in eine Zelle eingeführt wird, lokalisiert er seine Ziel-DNA-Sequenz und erzeugt einen Doppelstrangbruch (DSB). Der natürliche DNA-Reparaturmechanismus der Zelle übernimmt dann die weitere Arbeit. Der fehleranfällige Non-Homologous End Joining (NHEJ)-Weg führt häufig zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels), wodurch das Gen effektiv ausgeschaltet wird. Alternativ kann, wenn eine Donor-DNA-Matrize bereitgestellt wird, der präzisere Homology-Directed Repair (HDR)-Weg verwendet werden, um neue Sequenzen einzufügen oder Mutationen zu korrigieren.