CRISPR-Cas9 كأداة لتحرير الجينات قابلة للبرمجة

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in البيولوجيا الجزيئيةكانت الفكرة الأساسية هي إدراك إمكانية إعادة برمجة هذا النظام. في شكله الطبيعي، يستخدم نظام النوع الثاني ثلاثة مكونات: بروتين Cas9، وcrRNA الذي يحتوي على تسلسل الاستهداف، وtracrRNA الضروري لنضج crRNA وتفعيل Cas9. أثبت مختبرا دودنا وشاربنتييه إمكانية تبسيط هذا النظام. فقد صمما جزيء RNA هجينًا واحدًا، أطلقوا عليه اسم جزيء RNA الدليل المفرد (sgRNA)، وذلك بربط الطرف 3' لـ crRNA بالطرف 5' لـ tracrRNA باستخدام حلقة دبوس شعر اصطناعية. احتفظ sgRNA هذا بجميع الوظائف الضرورية لنظام RNA المزدوج.

كان هذا التبسيط ثوريًا لأنه يعني أنه لإعادة توجيه نوكلياز Cas9 إلى موقع DNA جديد، يكفي فقط تصنيع sgRNA جديد بتسلسل توجيه مختلف مكون من 20 نيوكليوتيدًا. جعل هذا التقنية سهلة الاستخدام، ورخيصة، وقابلة للتطوير بشكل ملحوظ مقارنةً بطرق التحرير السابقة مثل نوكليازات أصابع الزنك (ZFNs) وTALENs، التي كانت تتطلب هندسة بروتينية معقدة ومكلفة لكل هدف جديد. عند إدخال مركب Cas9-sgRNA إلى الخلية، فإنه يحدد تسلسل DNA المستهدف ويُحدث كسرًا في كلا سلسلتي الحمض النووي (DSB). ثم تتولى آلية إصلاح DNA الطبيعية في الخلية المهمة. غالبًا ما يُدخل مسار الربط غير المتجانس للنهايات (NHEJ)، المعرض للخطأ، إضافات أو حذفًا صغيرًا (indels)، مما يؤدي فعليًا إلى تعطيل الجين. بدلاً من ذلك، إذا تم توفير قالب DNA مانح، فيمكن استخدام مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) الأكثر دقة لإدخال تسلسلات جديدة أو تصحيح الطفرات.