CRISPR-Cas9 एक प्रोग्रामेबल जीन एडिटिंग उपकरण के रूप में

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in आणविक जीव विज्ञानइस प्रणाली की पुनर्प्रोग्रामिंग क्षमता को पहचानना ही मुख्य निष्कर्ष था। अपने प्राकृतिक रूप में, टाइप II प्रणाली तीन घटकों का उपयोग करती है: Cas9 प्रोटीन, एक crRNA जिसमें लक्ष्य अनुक्रम होता है, और एक tracrRNA जो crRNA के परिपक्वन और Cas9 के सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है। डौडना और चारपेंटियर की प्रयोगशालाओं ने प्रदर्शित किया कि इस प्रणाली को सरल बनाया जा सकता है। उन्होंने crRNA के 3' सिरे को tracrRNA के 5' सिरे से एक कृत्रिम हेयरपिन लूप द्वारा जोड़कर एक एकल काइमेरिक RNA का निर्माण किया, जिसे उन्होंने एकल-गाइड RNA (sgRNA) नाम दिया। इस sgRNA ने दोहरी RNA प्रणाली के सभी आवश्यक कार्यों को बरकरार रखा।

यह सरलीकरण क्रांतिकारी था क्योंकि इसका अर्थ यह था कि Cas9 न्यूक्लिएज़ को एक नए DNA स्थल पर पुनः लक्षित करने के लिए, केवल एक अलग 20-न्यूक्लियोटाइड गाइड अनुक्रम के साथ एक नए sgRNA का संश्लेषण करना आवश्यक था। इससे यह तकनीक जिंक फिंगर न्यूक्लिएज़ (ZFNs) और TALENs जैसी पिछली संपादन विधियों की तुलना में उपयोग में बेहद आसान, सस्ती और स्केलेबल बन गई, जिनमें प्रत्येक नए लक्ष्य के लिए जटिल और महंगी प्रोटीन इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती थी। जब Cas9-sgRNA कॉम्प्लेक्स को कोशिका में डाला जाता है, तो यह अपने लक्ष्य DNA अनुक्रम का पता लगाता है और एक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSB) बनाता है। फिर कोशिका की प्राकृतिक DNA मरम्मत प्रक्रिया कार्य करती है। त्रुटि-प्रवण नॉन-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (NHEJ) मार्ग अक्सर छोटे सम्मिलन या विलोपन (इंडल्स) उत्पन्न करता है, जिससे जीन प्रभावी रूप से निष्क्रिय हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, यदि एक दाता DNA टेम्पलेट प्रदान किया जाता है, तो नए अनुक्रमों को सम्मिलित करने या उत्परिवर्तनों को ठीक करने के लिए अधिक सटीक होमोलॉजी-डायरेक्टेड रिपेयर (HDR) मार्ग का उपयोग किया जा सकता है।