CRISPR-Cas9 como herramienta programable de edición genética

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in biología molecularLa clave fue reconocer su potencial de reprogramación. En su forma natural, el sistema de tipo II utiliza tres componentes: la proteína Cas9, un crRNA que contiene la secuencia diana y un tracrRNA crucial para la maduración del crRNA y la activación de Cas9. Los laboratorios de Doudna y Charpentier demostraron que este sistema podía simplificarse. Diseñaron un único ARN quimérico, al que denominaron ARN guía simple (sgRNA), uniendo el extremo 3' del crRNA al extremo 5' del tracrRNA mediante un bucle sintético en horquilla. Este sgRNA conservaba todas las funciones necesarias del sistema de doble ARN.

Esta simplificación fue revolucionaria porque significó que para redirigir la nucleasa Cas9 a un nuevo sitio de ADN, solo se necesitaba sintetizar un nuevo sgRNA con una secuencia guía diferente de 20 nucleótidos. Esto hizo que la tecnología fuera notablemente fácil de usar, económica y escalable en comparación con métodos de edición anteriores como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las TALEN, que requerían ingeniería de proteínas compleja y costosa para cada nuevo objetivo. Cuando el complejo Cas9-sgRNA se introduce en una célula, localiza su secuencia de ADN objetivo y crea una ruptura de doble cadena (DSB). La maquinaria de reparación de ADN natural de la célula toma entonces el control. La vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), propensa a errores, a menudo introduce pequeñas inserciones o deleciones (indels), lo que efectivamente inactiva el gen. Alternativamente, si se proporciona una plantilla de ADN donante, se puede utilizar la vía de reparación dirigida por homología (HDR), más precisa, para insertar nuevas secuencias o corregir mutaciones.