CRISPR-Cas9 como uma ferramenta programável de edição genética

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in biologia molecularA principal descoberta foi reconhecer seu potencial de reprogramação. Em sua forma natural, o sistema Tipo II utiliza três componentes: a proteína Cas9, um crRNA que contém a sequência de direcionamento e um tracrRNA, crucial para a maturação do crRNA e a ativação da Cas9. Os laboratórios de Doudna e Charpentier demonstraram que esse sistema poderia ser simplificado. Eles criaram um único RNA quimérico, que denominaram RNA guia único (sgRNA), ligando a extremidade 3' do crRNA à extremidade 5' do tracrRNA com uma alça sintética em grampo. Esse sgRNA reteve todas as funções necessárias do sistema de RNA duplo.

Essa simplificação foi revolucionária porque significava que, para redirecionar a nuclease Cas9 para um novo local de DNA, bastava sintetizar um novo sgRNA com uma sequência guia diferente de 20 nucleotídeos. Isso tornou a tecnologia notavelmente fácil de usar, barata e escalável em comparação com métodos de edição anteriores, como as nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e as TALENs, que exigiam engenharia de proteínas complexa e dispendiosa para cada novo alvo. Quando o complexo Cas9-sgRNA é introduzido em uma célula, ele localiza sua sequência de DNA alvo e cria uma quebra de fita dupla (DSB). O mecanismo natural de reparo de DNA da célula entra em ação. A via de junção de extremidades não homólogas (NHEJ), propensa a erros, frequentemente introduz pequenas inserções ou deleções (indels), efetivamente inativando o gene. Alternativamente, se um molde de DNA doador for fornecido, a via de reparo direcionado por homologia (HDR), mais precisa, pode ser usada para inserir novas sequências ou corrigir mutações.