Protospacer-Adjacent-Motif (PAM)
2008
- Luciano Marraffini
- Erik Sontheimer
Das Protospacer Adjacent Motif (PAM) ist eine kurze, spezifische DNA-Sequenz, typischerweise 2–6 Basenpaare lang, die für die Bindung und Spaltung einer Ziel-DNA-Sequenz durch eine Cas-Nuklease erforderlich ist. Es befindet sich unmittelbar stromabwärts der Zielsequenz (Protospacer) in der eindringenden DNA. Das PAM ist in der Wirts-DNA nicht vorhanden. CRISPR Locus, der als entscheidender Selbst-gegen-Nicht-Selbst-Erkennungsmechanismus dient und die Zerstörung durch Autoimmunität verhindert.
Die Entdeckung des Protospacer Adjacent Motif (PAM) war ein entscheidender Moment für das Verständnis der präzisen Funktionsweise des CRISPR-Cas-Systems. Forscher beobachteten, dass für die erfolgreiche Erkennung und Spaltung fremder DNA eine spezifische kurze Sequenz neben der Zielsequenz (dem Protospacer) vorhanden sein muss. Für das weit verbreitete Cas9 aus *Streptococcus pyogenes* lautet diese Sequenz 5'-NGG-3', wobei 'N' für jedes beliebige Nukleotid stehen kann. Das mit seiner Guide-RNA beladene Cas9-Protein scannt zunächst die DNA nach dieser PAM-Sequenz. Erst nach der Bindung an ein PAM versucht das Protein, die angrenzende DNA zu entwinden und auf eine Übereinstimmung mit seiner Guide-RNA-Sequenz zu prüfen. Wird eine Übereinstimmung gefunden, werden die Nukleasedomänen von Cas9 aktiviert, um einen Doppelstrangbruch zu erzeugen.
Dieser PAM-abhängige Targeting-Mechanismus ist der Schlüssel dazu, dass das System das bakterielle Genom nicht angreift. Das CRISPR-Array, von dem die Guide-RNAs abgeleitet sind, enthält dieselben Spacer-Sequenzen wie die Zielsequenzen. Die Repeat-Sequenzen innerhalb des CRISPR-Arrays enthalten jedoch keine PAM-Sequenz. Folglich kann der Cas9-gRNA-Komplex nicht stabil an den CRISPR-Locus selbst binden, wodurch eine Autoimmunreaktion verhindert wird. Diese elegante Lösung zur Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Strukturen ist ein Kennzeichen der Effizienz des Systems. Für Genomeditierungsanwendungen ist die PAM-Anforderung ein zweischneidiges Schwert: Sie gewährleistet Spezifität, schränkt aber gleichzeitig die Menge möglicher Zielstellen im Genom ein. Dies hat die Forschung zur Entdeckung oder Entwicklung von Cas-Varianten mit anderen, flexibleren oder sogar nicht vorhandenen PAM-Anforderungen vorangetrieben, um jeden Teil des Genoms für die Editierung zugänglich zu machen.
UNESCO Nomenclature: 2417
Molekularbiologie
Typ
Biochemischer Mechanismus
Verwendung
Weitverbreitete Verwendung
Vorläufer
- characterization of the crispr-cas9 system’s components
- Verständnis der Protein-DNA-Bindungsinteraktionen und -Spezifität
- Die Hypothese von Crispr als DNA-gerichtetes Immunsystem
- In-vitro-Tests zum Testen der CAS-Proteinaktivität auf verschiedenen DNA-Substraten
Anwendungen
- eine kritische Regel für die Entwicklung von Leit-RNAs bei der CRISPR-Cas9-Genbearbeitung
- Ermöglicht die Vorhersage potenzieller Off-Target-Stellen in einem Genom
- Entwicklung von CAS-Proteinen mit veränderten PAM-Spezifitäten, um den Bereich editierbarer genomischer Stellen zu erweitern
- eine Grundlage für die Entwicklung hochpräziser Cas9-Varianten, die Off-Target-Effekte reduzieren
Potenzielle Innovationsideen
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Verwandt mit: PAM, Protospacer Adjacent Motif, Cas9, Selbsterkennung, DNA-Targeting, Genomeditierung, S. pyogenes, Off-Target, Biochemie, NGG.