Motif adjacent au protoespaceur (PAM)
2008
- Luciano Marraffini
- Erik Sontheimer
Le motif adjacent au protospacer (PAM) est une courte séquence d'ADN spécifique, généralement de 2 à 6 paires de bases, nécessaire à la liaison et au clivage d'une séquence d'ADN cible par une nucléase Cas. Il est situé immédiatement en aval du site cible (protospacer) dans l'ADN envahissant. Le PAM est absent de l'ADN hôte. CRISPR ce locus, qui joue le rôle de mécanisme essentiel de reconnaissance du soi par rapport au non-soi, empêchant ainsi la destruction auto-immune.
La découverte du motif PAM (Protospacer Adjacent Motif) a constitué un tournant décisif dans la compréhension du fonctionnement précis du système CRISPR-Cas. Les chercheurs ont observé que, pour que le système cible et clive efficacement l'ADN étranger, une courte séquence spécifique devait être présente à proximité de la séquence cible (le protospacer). Chez la protéine Cas9, largement utilisée et issue de *Streptococcus pyogenes*, cette séquence est 5'-NGG-3', où N' représente n'importe quel nucléotide. La protéine Cas9, chargée de son ARN guide, recherche d'abord cette séquence PAM dans l'ADN. Ce n'est qu'après sa liaison à un PAM que la protéine tente de dérouler l'ADN adjacent et de vérifier sa correspondance avec la séquence de son ARN guide. Si une correspondance est trouvée, les domaines nucléases de Cas9 sont activés pour créer une cassure double brin.
Ce mécanisme de ciblage dépendant du PAM est essentiel pour que le système évite d'attaquer le génome de la bactérie. Le réseau CRISPR, à partir duquel sont dérivés les ARN guides, contient les mêmes séquences d'espacement que les cibles. Cependant, les séquences répétées au sein du réseau CRISPR ne contiennent pas la séquence PAM. Par conséquent, le complexe Cas9-ARNg ne peut se lier de manière stable au locus CRISPR lui-même, empêchant ainsi une réaction auto-immune catastrophique. Cette solution élégante de discrimination entre le soi et le non-soi est un atout majeur du système. Pour les applications d'édition génique, l'exigence du PAM est une arme à double tranchant : elle garantit la spécificité, mais restreint également l'ensemble des sites cibles possibles dans un génome. Ceci a motivé d'importantes recherches visant à découvrir ou à concevoir des variants de Cas avec des exigences en PAM différentes, plus flexibles, voire inexistantes, afin de rendre accessible l'édition à n'importe quelle partie du génome.
UNESCO Nomenclature: 2417
– Biologie moléculaire
Taper
Mécanisme biochimique
Usage
Utilisation généralisée
Précurseurs
- characterization of the crispr-cas9 system’s components
- compréhension des interactions et de la spécificité de la liaison protéine-ADN
- l'hypothèse de Crispr comme système immunitaire ciblant l'ADN
- tests in vitro pour tester l'activité de la protéine cas sur différents substrats d'ADN
Applications
- une règle critique pour la conception d'ARN guides dans l'édition génétique CRISPR-Cas9
- permettant la prédiction de sites potentiellement hors cible dans un génome
- Ingénierie des protéines Cas avec des spécificités PAM modifiées pour élargir la gamme des sites génomiques modifiables
- une base pour le développement de variantes cas9 haute fidélité qui réduisent les effets hors cible
Idées d'innovations potentielles
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Lié à : PAM, motif adjacent au protospacer, cas9, auto-reconnaissance, ciblage de l'ADN, édition génique, s. pyogenes, hors cible, biochimie, NGG.