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Motivo adjacente ao protoespaçador (PAM)

2008
  • Luciano Marraffini
  • Erik Sontheimer
Molecular biologist analyzing DNA sequence with focus on Protospacer Adjacent Motif in a laboratory.

(Imagem gerada apenas para fins ilustrativos)

O Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM, na sigla em inglês) é uma sequência de DNA curta e específica, tipicamente de 2 a 6 pares de bases, necessária para que uma nuclease Cas se ligue e clive uma sequência de DNA alvo. Ele está localizado imediatamente a jusante do sítio alvo (protoespaçador) no DNA invasor. O PAM não está presente no próprio DNA hospedeiro. CRISPR locus, que serve como um mecanismo crítico de reconhecimento entre o próprio e o não próprio, prevenindo a destruição autoimune.

A descoberta do Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM, na sigla em inglês) foi um momento crucial para a compreensão do funcionamento preciso do sistema CRISPR-Cas. Os pesquisadores observaram que, para o sistema atingir e clivar o DNA exógeno com sucesso, uma pequena sequência específica precisava estar presente próxima à sequência alvo (o protoespaçador). Para a Cas9, amplamente utilizada e proveniente da bactéria *Streptococcus pyogenes*, essa sequência é 5'-NGG-3', onde 'N' pode ser qualquer nucleotídeo. A proteína Cas9, carregada com seu RNA guia, primeiro examina o DNA em busca dessa sequência PAM. Somente ao se ligar a um PAM, a proteína tenta desenrolar o DNA adjacente e verificar se há correspondência com a sequência do seu RNA guia. Se uma correspondência for encontrada, os domínios de nuclease da Cas9 são ativados para criar uma quebra de fita dupla.

Esse mecanismo de direcionamento dependente de PAM é a chave para o sistema evitar atacar o próprio genoma da bactéria. O conjunto CRISPR, do qual os RNAs guia são derivados, contém as mesmas sequências espaçadoras que os alvos. No entanto, as sequências repetidas dentro do conjunto CRISPR não contêm a sequência PAM. Consequentemente, o complexo Cas9-gRNA não consegue se ligar de forma estável ao próprio lócus CRISPR, prevenindo uma catástrofe autoimune. Essa solução elegante para a discriminação entre o próprio e o não próprio é uma característica marcante da eficiência do sistema. Para aplicações de edição genética, a exigência de PAM é uma faca de dois gumes: garante especificidade, mas também restringe o conjunto de possíveis sítios-alvo em um genoma. Isso impulsionou pesquisas significativas na descoberta ou engenharia de variantes Cas com requisitos de PAM diferentes, mais flexíveis ou até mesmo inexistentes, para tornar qualquer parte do genoma acessível à edição.

UNESCO Nomenclature: 2417
Biologia molecular

Tipo

Mecanismo Bioquímico

Interrupção

Substancial

Uso

Uso generalizado

Precursores

  • characterization of the crispr-cas9 system’s components
  • Compreensão das interações de ligação proteína-DNA e especificidade
  • a hipótese do CRISPR como um sistema imunológico direcionado ao DNA
  • Ensaios in vitro para testar a atividade da proteína Cas em diferentes substratos de DNA.

Aplicações

  • Uma regra crucial para o projeto de RNAs guia na edição genética CRISPR-Cas9.
  • permitindo a previsão de potenciais locais fora do alvo em um genoma.
  • Engenharia de proteínas Cas com especificidades PAM alteradas para expandir a gama de sítios genômicos editáveis.
  • uma base para o desenvolvimento de variantes Cas9 de alta fidelidade que reduzem os efeitos fora do alvo

Patentes:

NA

Ideias de Inovação Potencial

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Relacionado a: PAM, motivo adjacente ao protoespaçador, cas9, autorreconhecimento, direcionamento de DNA, edição genética, s. pyogenes, alvo não específico, bioquímica, NGG.

Contexto histórico

Motivo adjacente ao protoespaçador (PAM)

1990
1997
2000
2008
1990
1990
1997
2000

(Caso a data seja desconhecida ou irrelevante, por exemplo, "mecânica dos fluidos", é fornecida uma estimativa aproximada de seu surgimento notável)

Princípios relacionados à invenção, inovação e tecnologia

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