CRISPR-Cas9 als programmierbares Werkzeug zur Genom-Editierung

Die Umwandlung des bakteriellen Immunsystems CRISPR-Cas9 in ein universelles Werkzeug für die Genom-Editierung war ein Meilenstein in der Molekularbiologie. Der entscheidende Erkenntnisgewinn bestand darin, das Potenzial für eine Neuprogrammierung zu erkennen. In seiner natürlichen Form verwendet das Typ-II-System drei Komponenten: das Cas9-Protein, eine crRNA, die die Zielsequenz enthält, und eine tracrRNA, die für die Reifung der crRNA und die Aktivierung von Cas9 entscheidend ist. Die Labore von Doudna und Charpentier zeigten, dass dieses System vereinfacht werden kann. Sie entwickelten eine einzige chimäre RNA, die sie als Single-Guide-RNA (sgRNA) bezeichneten, indem sie das 3'-Ende der crRNA mit dem 5'-Ende der tracrRNA durch eine synthetische Haarnadelschleife verbanden. Diese sgRNA behielt alle notwendigen Funktionen des Dual-RNA-Systems bei.

Diese Vereinfachung war revolutionär, da sie bedeutete, dass man, um die Cas9-Nuklease auf eine neue DNA-Stelle auszurichten, lediglich eine neue sgRNA mit einer anderen 20-Nukleotid-Führungssequenz synthetisieren musste. Dadurch wurde die Technologie im Vergleich zu früheren Bearbeitungsmethoden wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) und TALENs, die für jedes neue Ziel eine komplexe und kostspielige Proteinentwicklung erforderten, bemerkenswert einfach, kostengünstig und skalierbar. Wenn der Cas9-sgRNA-Komplex in eine Zelle eingeführt wird, lokalisiert er seine Ziel-DNA-Sequenz und erzeugt einen Doppelstrangbruch (DSB). Der natürliche DNA-Reparaturmechanismus der Zelle übernimmt dann die weitere Arbeit. Der fehleranfällige Non-Homologous End Joining (NHEJ)-Weg führt häufig zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels), wodurch das Gen effektiv ausgeschaltet wird. Alternativ kann, wenn eine Donor-DNA-Matrize bereitgestellt wird, der präzisere Homology-Directed Repair (HDR)-Weg verwendet werden, um neue Sequenzen einzufügen oder Mutationen zu korrigieren.