Motivo adiacente al protospacer (PAM)
2008
- Luciano Marraffini
- Erik Sontheimer
Il motivo adiacente al protospacer (PAM) è una breve e specifica sequenza di DNA, tipicamente lunga da 2 a 6 paia di basi, necessaria affinché una nucleasi Cas si leghi e tagli una sequenza di DNA bersaglio. Si trova immediatamente a valle del sito bersaglio (protospacer) nel DNA invasore. Il PAM non è presente nel DNA dell'ospite. CRISPR locus, che funge da meccanismo critico di riconoscimento del sé rispetto al non-sé, prevenendo la distruzione autoimmune.
La scoperta del Protospacer Adjacent Motif (PAM) è stata un momento cruciale per comprendere il funzionamento del sistema CRISPR-Cas con tale precisione. I ricercatori hanno osservato che, affinché il sistema potesse individuare e tagliare con successo il DNA estraneo, era necessaria la presenza di una specifica sequenza breve accanto alla sequenza bersaglio (il protospacer). Per la proteina Cas9, ampiamente utilizzata e derivata da *Streptococcus pyogenes*, questa sequenza è 5'-NGG-3', dove 'N' può essere un qualsiasi nucleotide. La proteina Cas9, caricata con il suo RNA guida, analizza inizialmente il DNA alla ricerca di questa sequenza PAM. Solo dopo essersi legata a un PAM, la proteina tenta di svolgere il DNA adiacente e verifica la presenza di una corrispondenza con la sua sequenza di RNA guida. Se viene trovata una corrispondenza, i domini nucleasici di Cas9 vengono attivati per creare una rottura a doppio filamento.
Questo meccanismo di targeting dipendente dalla sequenza PAM è la chiave per cui il sistema evita di attaccare il genoma del batterio stesso. L'array CRISPR, da cui derivano gli RNA guida, contiene le stesse sequenze spaziatrici dei bersagli. Tuttavia, le sequenze ripetute all'interno dell'array CRISPR non contengono la sequenza PAM. Di conseguenza, il complesso Cas9-gRNA non può legarsi stabilmente al locus CRISPR stesso, prevenendo una catastrofe autoimmune. Questa elegante soluzione per la discriminazione tra sé e non-sé è un segno distintivo dell'efficienza del sistema. Per le applicazioni di editing genetico, il requisito della sequenza PAM è un'arma a doppio taglio: garantisce la specificità ma limita anche l'insieme dei possibili siti bersaglio in un genoma. Ciò ha stimolato una significativa ricerca volta a scoprire o ingegnerizzare varianti di Cas con requisiti PAM diversi, più flessibili o addirittura inesistenti, per rendere qualsiasi parte del genoma accessibile all'editing.
UNESCO Nomenclature: 2417
Biologia molecolare
Tipo
Meccanismo biochimico
Precursori
- characterization of the crispr-cas9 system’s components
- comprensione delle interazioni e della specificità del legame proteina-DNA
- l'ipotesi di Crispr come sistema immunitario che prende di mira il DNA
- saggi in vitro per testare l'attività della proteina cas su diversi substrati di DNA
Applicazioni
- una regola critica per la progettazione di RNA guida nell'editing genetico CRISPR-Cas9
- consentendo la previsione di potenziali siti fuori bersaglio in un genoma
- proteine cas ingegnerizzate con specificità pam alterate per ampliare la gamma di siti genomici modificabili
- una base per lo sviluppo di varianti cas9 ad alta fedeltà che riducono gli effetti off-target
Idee e potenziali innovazioni
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Correlato a: PAM, motivo adiacente al protospacer, cas9, auto-riconoscimento, targeting del DNA, editing genetico, s. pyogenes, fuori bersaglio, biochimica, NGG.