CRISPR-Cas9 como herramienta programable de edición genética

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in molecular biology. The key insight was recognizing its potential for being reprogrammed. In its natural form, the Type II system uses three components: the Cas9 protein, a crRNA that contains the targeting sequence, and a tracrRNA that is crucial for crRNA maturation and Cas9 activation. The Doudna and Charpentier labs demonstrated that this system could be simplified. They engineered a single chimeric RNA, which they termed a single-guide RNA (sgRNA), by linking the 3′ end of the crRNA to the 5′ end of the tracrRNA with a synthetic hairpin loop. This sgRNA retained all the necessary functions of the dual-RNA system.

Esta simplificación fue revolucionaria porque significó que para redirigir la nucleasa Cas9 a un nuevo sitio de ADN, solo se necesitaba sintetizar un nuevo sgRNA con una secuencia guía diferente de 20 nucleótidos. Esto hizo que la tecnología fuera notablemente fácil de usar, económica y escalable en comparación con métodos de edición anteriores como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las TALEN, que requerían ingeniería de proteínas compleja y costosa para cada nuevo objetivo. Cuando el complejo Cas9-sgRNA se introduce en una célula, localiza su secuencia de ADN objetivo y crea una ruptura de doble cadena (DSB). La maquinaria de reparación de ADN natural de la célula toma entonces el control. La vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), propensa a errores, a menudo introduce pequeñas inserciones o deleciones (indels), lo que efectivamente inactiva el gen. Alternativamente, si se proporciona una plantilla de ADN donante, se puede utilizar la vía de reparación dirigida por homología (HDR), más precisa, para insertar nuevas secuencias o corregir mutaciones.