CRISPR-Cas9 एक प्रोग्रामेबल जीन एडिटिंग उपकरण के रूप में

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in molecular biology. The key insight was recognizing its potential for being reprogrammed. In its natural form, the Type II system uses three components: the Cas9 protein, a crRNA that contains the targeting sequence, and a tracrRNA that is crucial for crRNA maturation and Cas9 activation. The Doudna and Charpentier labs demonstrated that this system could be simplified. They engineered a single chimeric RNA, which they termed a single-guide RNA (sgRNA), by linking the 3′ end of the crRNA to the 5′ end of the tracrRNA with a synthetic hairpin loop. This sgRNA retained all the necessary functions of the dual-RNA system.

यह सरलीकरण क्रांतिकारी था क्योंकि इसका अर्थ यह था कि Cas9 न्यूक्लिएज़ को एक नए DNA स्थल पर पुनः लक्षित करने के लिए, केवल एक अलग 20-न्यूक्लियोटाइड गाइड अनुक्रम के साथ एक नए sgRNA का संश्लेषण करना आवश्यक था। इससे यह तकनीक जिंक फिंगर न्यूक्लिएज़ (ZFNs) और TALENs जैसी पिछली संपादन विधियों की तुलना में उपयोग में बेहद आसान, सस्ती और स्केलेबल बन गई, जिनमें प्रत्येक नए लक्ष्य के लिए जटिल और महंगी प्रोटीन इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती थी। जब Cas9-sgRNA कॉम्प्लेक्स को कोशिका में डाला जाता है, तो यह अपने लक्ष्य DNA अनुक्रम का पता लगाता है और एक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSB) बनाता है। फिर कोशिका की प्राकृतिक DNA मरम्मत प्रक्रिया कार्य करती है। त्रुटि-प्रवण नॉन-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (NHEJ) मार्ग अक्सर छोटे सम्मिलन या विलोपन (इंडल्स) उत्पन्न करता है, जिससे जीन प्रभावी रूप से निष्क्रिय हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, यदि एक दाता DNA टेम्पलेट प्रदान किया जाता है, तो नए अनुक्रमों को सम्मिलित करने या उत्परिवर्तनों को ठीक करने के लिए अधिक सटीक होमोलॉजी-डायरेक्टेड रिपेयर (HDR) मार्ग का उपयोग किया जा सकता है।