プログラム可能な遺伝子編集ツールとしてのCRISPR-Cas9

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in molecular biology. The key insight was recognizing its potential for being reprogrammed. In its natural form, the Type II system uses three components: the Cas9 protein, a crRNA that contains the targeting sequence, and a tracrRNA that is crucial for crRNA maturation and Cas9 activation. The Doudna and Charpentier labs demonstrated that this system could be simplified. They engineered a single chimeric RNA, which they termed a single-guide RNA (sgRNA), by linking the 3′ end of the crRNA to the 5′ end of the tracrRNA with a synthetic hairpin loop. This sgRNA retained all the necessary functions of the dual-RNA system.

この簡略化は画期的でした。なぜなら、Cas9ヌクレアーゼを新しいDNA部位に再標的化するには、異なる20ヌクレオチドのガイド配列を持つ新しいsgRNAを合成するだけで済むようになったからです。これにより、この技術は、新しい標的ごとに複雑で高価なタンパク質工学を必要とする従来のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）やTALENなどの編集方法と比較して、非常に使いやすく、安価で、拡張性のあるものになりました。Cas9-sgRNA複合体が細胞に導入されると、標的DNA配列を見つけて二本鎖切断（DSB）を引き起こします。その後、細胞の自然なDNA修復機構が作動します。エラーを起こしやすい非相同末端結合（NHEJ）経路は、小さな挿入または欠失（インデル）を導入することが多く、結果として遺伝子をノックアウトします。あるいは、ドナーDNAテンプレートが提供される場合は、より正確な相同組換え修復（HDR）経路を使用して、新しい配列を挿入したり、変異を修正したりできます。