CRISPR-Cas9 كأداة لتحرير الجينات قابلة للبرمجة

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in molecular biology. The key insight was recognizing its potential for being reprogrammed. In its natural form, the Type II system uses three components: the Cas9 protein, a crRNA that contains the targeting sequence, and a tracrRNA that is crucial for crRNA maturation and Cas9 activation. The Doudna and Charpentier labs demonstrated that this system could be simplified. They engineered a single chimeric RNA, which they termed a single-guide RNA (sgRNA), by linking the 3′ end of the crRNA to the 5′ end of the tracrRNA with a synthetic hairpin loop. This sgRNA retained all the necessary functions of the dual-RNA system.

كان هذا التبسيط ثوريًا لأنه يعني أنه لإعادة توجيه نوكلياز Cas9 إلى موقع DNA جديد، يكفي فقط تصنيع sgRNA جديد بتسلسل توجيه مختلف مكون من 20 نيوكليوتيدًا. جعل هذا التقنية سهلة الاستخدام، ورخيصة، وقابلة للتطوير بشكل ملحوظ مقارنةً بطرق التحرير السابقة مثل نوكليازات أصابع الزنك (ZFNs) وTALENs، التي كانت تتطلب هندسة بروتينية معقدة ومكلفة لكل هدف جديد. عند إدخال مركب Cas9-sgRNA إلى الخلية، فإنه يحدد تسلسل DNA المستهدف ويُحدث كسرًا في كلا سلسلتي الحمض النووي (DSB). ثم تتولى آلية إصلاح DNA الطبيعية في الخلية المهمة. غالبًا ما يُدخل مسار الربط غير المتجانس للنهايات (NHEJ)، المعرض للخطأ، إضافات أو حذفًا صغيرًا (indels)، مما يؤدي فعليًا إلى تعطيل الجين. بدلاً من ذلك، إذا تم توفير قالب DNA مانح، فيمكن استخدام مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) الأكثر دقة لإدخال تسلسلات جديدة أو تصحيح الطفرات.