CRISPR-Cas9 como uma ferramenta programável de edição genética

The transformation of the CRISPR-Cas9 bacterial immune system into a universal tool for genome editing was a landmark achievement in molecular biology. The key insight was recognizing its potential for being reprogrammed. In its natural form, the Type II system uses three components: the Cas9 protein, a crRNA that contains the targeting sequence, and a tracrRNA that is crucial for crRNA maturation and Cas9 activation. The Doudna and Charpentier labs demonstrated that this system could be simplified. They engineered a single chimeric RNA, which they termed a single-guide RNA (sgRNA), by linking the 3′ end of the crRNA to the 5′ end of the tracrRNA with a synthetic hairpin loop. This sgRNA retained all the necessary functions of the dual-RNA system.

Essa simplificação foi revolucionária porque significava que, para redirecionar a nuclease Cas9 para um novo local de DNA, bastava sintetizar um novo sgRNA com uma sequência guia diferente de 20 nucleotídeos. Isso tornou a tecnologia notavelmente fácil de usar, barata e escalável em comparação com métodos de edição anteriores, como as nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e as TALENs, que exigiam engenharia de proteínas complexa e dispendiosa para cada novo alvo. Quando o complexo Cas9-sgRNA é introduzido em uma célula, ele localiza sua sequência de DNA alvo e cria uma quebra de fita dupla (DSB). O mecanismo natural de reparo de DNA da célula entra em ação. A via de junção de extremidades não homólogas (NHEJ), propensa a erros, frequentemente introduz pequenas inserções ou deleções (indels), efetivamente inativando o gene. Alternativamente, se um molde de DNA doador for fornecido, a via de reparo direcionado por homologia (HDR), mais precisa, pode ser usada para inserir novas sequências ou corrigir mutações.