Motivo adyacente al protoespaciador (PAM)
2008
- Luciano Marraffini
- Erik Sontheimer
El motivo adyacente al protoespaciador (PAM) es una secuencia de ADN corta y específica, normalmente de 2 a 6 pares de bases de longitud, necesaria para que una nucleasa Cas se una a una secuencia de ADN diana y la corte. Se encuentra inmediatamente aguas abajo del sitio diana (protospacer) en el ADN invasor. El PAM no está presente en el ADN del huésped. CRISPR que sirve como mecanismo crítico de reconocimiento de sí mismo frente a lo que no es, impidiendo la destrucción autoinmune.
El descubrimiento del Protospacer Adjacent Motif (PAM) fue un momento crucial para entender cómo funciona el sistema CRISPR-Cas con tanta precisión. Los investigadores observaron que para que el sistema se dirigiera con éxito al ADN extraño y lo cortara, tenía que haber una secuencia corta específica junto a la secuencia diana (el protoespaciador). Para el ampliamente utilizado Cas9 de *Streptococcus pyogenes*, esta secuencia es 5′-NGG-3′, donde ‘N’ puede ser cualquier nucleótido. La proteína Cas9, cargada con su ARN guía, busca primero esta secuencia PAM en el ADN. Sólo cuando se une a una PAM, la proteína intenta desenrollar el ADN adyacente y comprobar si coincide con su secuencia de ARN guía. Si se encuentra una coincidencia, los dominios nucleasa de Cas9 se activan para crear una rotura de doble cadena.
Este mecanismo de selección dependiente de PAM es la clave para evitar que el sistema ataque el propio genoma de la bacteria. La matriz CRISPR, de la que derivan los ARN guía, contiene las mismas secuencias espaciadoras que las dianas. Sin embargo, las secuencias repetidas dentro de la matriz CRISPR no contienen la secuencia PAM. En consecuencia, el complejo Cas9-ARNg no puede unirse de forma estable al propio locus CRISPR, evitando una catástrofe autoinmune. Esta elegante solución para la discriminación entre uno mismo y no uno mismo es un sello distintivo de la eficacia del sistema. Para las aplicaciones de edición genética, el requisito de PAM es un arma de doble filo: garantiza la especificidad, pero también limita el conjunto de posibles sitios diana en un genoma. Esto ha impulsado una importante investigación para descubrir o diseñar variantes de Cas con requisitos PAM diferentes, más flexibles o incluso inexistentes, para que cualquier parte del genoma sea accesible a la edición.
UNESCO Nomenclature: 2417
- Biología molecular
Tipo
Mecanismo bioquímico
Precursores
- characterization of the crispr-cas9 system’s components
- Comprensión de las interacciones y la especificidad de la unión proteína-ADN
- La hipótesis de CRISPR como un sistema inmunológico dirigido al ADN
- Ensayos in vitro para probar la actividad de la proteína cas en diferentes sustratos de ADN
Aplicaciones
- Una regla crítica para el diseño de ARN guía en la edición genética CRISPR-Cas9
- Permitiendo la predicción de posibles sitios fuera del objetivo en un genoma
- Ingeniería de proteínas cas con especificidades pam alteradas para ampliar la gama de sitios genómicos editables
- Una base para desarrollar variantes de cas9 de alta fidelidad que reduzcan los efectos fuera del objetivo
Ideas para posibles innovaciones
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Relacionado con: PAM, motivo adyacente protospacer, cas9, autorreconocimiento, DNA targeting, edición génica, s. pyogenes, off-target, bioquímica, NGG.